DNA Extraction from Mosquito (2)

1. Put each mosquito in 100microl of DNAZOl (Invitrogen) and grind them.
2. centrifuge 10min at 10,000g at 15°C
3. Transfer supernatant to new tube
4. add 50microliter of 100% EtOH Mix by inverting the tubes 5-8 times and hold 5 min at room temperature.
5. centrifuge 0min at 10,000g at 15°C and remove the supernatant.
6. Wash the DNA pellet with 1.0ml of 75% EtOH and invert tube 3-6 times to mix. Centrifuge 10min at 10,000g.
7. Repeat step 6.
8. Remove the remaining EtOH and dry pellet.
9. resuspend the dry pellet with 100microliter of free DNAse Water let it overnight at 4°C to maximize pellet rehydratation.
10. Storage at -80°C

DNA Extraction from Mosquito (1)

Lysis buffer Composition:
1M Tris-HCl pH 8.0……………...100ul
0.5M EDTA……………………….20ul
3M NaCl………………………….330ul
10% SDS…………………………500ul
Sterile water upto……...........……..10ml

Procedure:
• Take single mosquito in an eppendorf tube and add 50ul lysis buffer.
• Homogenize in Ice
• Add equal volume of Phenol
• Centrifuge at 8000rpm for 10 mins
• Take the supernatant
• Add equal volume of Chloroform-Isoamylalchohol(24:1) mixture
• Centrifuge at 8000 rpm for 10 mins and take the supernatant
• Add 1/10th volume of 3M sodium acetate
• Add 2.5 volume of chilled Ethanol
• Keep at -20°c overnight
• Centrifuge at 10,000rpm for 5 mins
• Decant the supernatant
• Wash with 70% alchohol
• Centrifuge at 10,000rpm for 5min
• Decant the supernatant
• Air dry the pellet
• Dissolve the pellet in 50ul of sterile water.

DNA Extraction from Mosquito (0)

1. Put 1 mosquito into an eppendorf tube with 100ul 50% w/v Chelex 100 in water.
   
2. Squish fly with pestle and place at 100C for 10 minutes.
   
3. Spin at top speed in a microfuge (>14,000xg) for 1 minute.
   
4. Transfer 10ul supernatant to new tube and add 1ul Proteinase K (0.8 units).
   
5. Incubate at 37C for 30min.
   
6. Incubate at 100C for 5 min.
   
7. Use 0.5ul as template in a 10ul PCR reaction.
   

Reagents (from Sigma):
Chelex 100 (C7901-25G) sodium form chelating resin (iminodiacetic acid)

Pemeriksaan Lymphatic Filariasis Pada Sediaan Darah

Pendahuluan

Beberapa penyakit tropis yang terabaikan (Neglected Tropical Diseases, NTD) masih ditemukan pada populasi miskin di negara berkembang. Terdapat 17 jenis penyakit NTD yang berasal dari 4 jenis agen/penyebab penyakit yang berbeda yaitu virus, bakteri, cacing, maupun protozoa. Salah satu penyakit NTD yang disebabkan oleh cacing dan saat ini masih ditemukan di Indonesia adalah lymphatic filariasis.¹

 Lymphatic filariasis atau lebih dikenal sebagai penyakit kaki gajah (elephantiasis) adalah penyakit infeksi akibat cacing filaria (mikrofilaria). Ada 3 spesies mikrofilaria penyebab penyakit ini yaitu Wuchereria bancrofti (ditemukan pada 90% kasus filariasis di dunia), Brugia malayi, dan Brugia timori.^2,3 Semua spesies tersebut terdapat di Indonesia, namun lebih dari 70% kasus filariasis di Indonesia disebabkan oleh Brugia malayi.⁴

Manusia terinfeksi melalui gigitan nyamuk vektor yang mengandung larva infektif (L3) dari spesies mikrofilaria tersebut. Meskipun jarang menimbulkan kematian, cacing filaria yang berkembangbiak di dalam pembuluh limfe akan menyebabkan kerusakan dan penyumbatan pada saluran limfatik dan pada stadium akhir dari kasus kronis sering ditemukan pembengkakan (kecacatan) pada kaki, tangan, maupun organ genital. Upaya pencegahan dan infeksi awal dapat dilakukan dengan pemberian obat anti-filaria. Namun pada kondisi yang sudah terjadi pembengkakan diperlukan langkah dan tata laksana kasus yang berbeda.^1,4  Pada tahun 2000 lalu, WHO membentuk Global Programme to Eliminate Lymphatic Filariasis (GPELF) dengan maksud untuk mengeliminasi penyakit ini pada 2020.⁵

               

Diagnosa Laboratorium

Baku emas pemeriksaan laboratorium untuk menegakkan diagnosa filaria adalah pemeriksaan secara mikroskopis pada sediaan darah jari (SDJ). Pengambilan sampel darah dilakukan pada pukul 22.00 malam sampai 02.00 dini hari sesuai periodisitas dari spesies cacing filaria. Namun saat ini di pasaran telah tersedia kit immunochromatographic card test (ICT) yang mempunyai sensitivitas dan spesifisitas yang tinggi. Teknik ini untuk mendeteksi adanya antigen dari W. bancrofti dari sampel dengan membutuhkan 100 uL darah.⁶ Ada pula uji cepat untuk mendeteksi antibodi terhadap Brugia spesies (Brugia Rapid Test). Pengambilan sampel darah dapat dilakukan pada siang maupun malam hari. Teknik pemeriksaan filaria pada sediaan darah jari (SDJ) akan dijelaskan di bawah ini⁷.

 

A.      Pembuatan Sediaan Darah Jari untuk Pemeriksaan Mikrofilaria dalam Darah Tepi

1.         Kenakan sarung tangan sebelum memulai proses;

2.         Siapkan kaca slide berlabel yang bersih dan bebas lemak, beri label/kode;

3.         Bersihkan ujung jari yang akan diambil darahnya (jari tengah atau jari manis) dengan kapas alkohol dan keringkan dengan kapas atau tisu yang bersih;

4.         Tusuk sisi bagian dalam jari dengan menggunakan jarum penusuk yang steril;

5.         Tekan jari tersebut dengan lembut dan kumpulkan 60 uL darah ke dalam tabung kapiler non heparin yang telah ditera;

6.         Posisikan tabung kapiler secara horizontal (merata) saat mengumpulkan darah agar darah dapat masuk ke dalam tabung dengan lancar;

7.         Bersihkan sisa darah pada ujung jari dengan kapas dan pasien diminta memegang kapas tersebut sampai darah berhenti mengalir;

8.         Teteskan darah dalam tabung kapiler di tiga titik pada permukaan kaca slide secara berseling (masing-masing titik 20 uL darah). Dengan tutup jarum penusuk, ratakan darah membentuk tiga jalur paralel seperti pada gambar 1 dibawah ini (masing-masing jalur paralel darah berukuran lebar X panjang = 0,5 X 4 cm). Untuk memudahkan dapat diletakkan pola panjang hapusan darah di bawah kaca slide;

9.         Biarkan sediaan darah pada kaca slide mengering dengan menempatkannya pada posisi horizontal di tempat yang aman sampai proses pengumpulan darah selesai.

 

B.      Pewarnaan Sedian Darah Jari

1.         Lakukan pewarnaan sediaan darah, 24 - 32 jam setelah pengambilan darah dan sediaan darah sudah kering sempurna dengan bantuan udara;

2.         Dehemoglobinasi sediaan darah menggunakan air suling atau air kemasan botol merek tertentu yang memiliki pH 7,2 dengan cara merendam sediaan darah di dalam air sampai air berwarna merah dan jalur paralel darah pada slide berwarna putih susu. Buang air dengan hati-hati, kemudian susun slide dalam rak pewarnaan dan dibiarkan mengering di udara selama 10-20 menit;

3.         Teteskan metanol pada slide yang sudah kering selama 1 menit;

4.         Lanjutkan dengan pewarnaan menggunakan larutan Giemsa 3% selama 30 menit;

5.         Bersihkan warna larutan Giemsa yang menempel pada kaca slide dengan mencelupkannya ke dalam sebaskom air kemudian slide dibiarkan kering sempurna dengan bantuan udara. Slide diposisikan berdiri dengan kemiringan 45 derajat agar air dapat mengalir turun. Apabila tidak dapat langsung diperiksa, simpan slide di dalam kotak slide.

 

C.      Pemeriksaan Mikroskopis

1.   Untuk menemukan filaria pada preparat digunakan perbesaran obyektif 10X10;   

2. Jumlah mikrofilaria yang ditemukan di semua lapangan pandang dihitung. Agar tidak terlewatkan dan setiap lapangan pandang dapat diperiksa, pengamatan dimulai dari tepi kiri kemudian digeser ke kanan sampai tepi preparat. Dilanjutkan ke bidang pandang berikutnya dan menggeser ke arah yang berlawanan ke tepi lagi. 

 

Daftar Pustaka

1.  WHO, n.d., The 17 Neglected Tropical Diseases, diakses dari http://www.who.int/neglected_diseases/diseases/en/, tanggal 1 Juli 2014

2.       WHO, Maret 2014, Lymphatic Filariasis,  diakses dari http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs102/en/, tanggal 1 Juli 2014

3.       WHO, n.d., Filariasis, diakses dari  http://www.who.int/topics/filariasis/en/ ; tanggal 1 Juli 2014

4.       Kemenkes RI, Juni 2010, Filariasis di Indonesia, Buletin Jendela Epidemiologi, Volume 1, Pusat Data dan Surveilans Epidemiologi Kementrian Kesehatan RI, diakses dari http://www.depkes.go.id/downloads/publikasi/buletin/BULETIN%20FILARIASIS.pdf , tanggal 1 Juli 2014

5.       WHO, n.d., Continue to March towards Elimination of Lymphatic Filariasis, diakses dari http://www.searo.who.int/entity/vector_borne_tropical_diseases/topics/lymphatic_filariasis/Progress_LF/en/, tanggal 1 Juli 2014

6.       WHO, n.d., Form of Lymphatic Filariasis and Diagnosis,  diakses dari  http://www.who.int/lymphatic_filariasis/epidemiology/epidemiology_forms/en/,  tanggal 1 Juli 2014  

7. Kemenkes RI, 2014, Panduan Pemeriksaan Lymphatic Filariasis Dengan Metode Survei Darah Jari, Subdit Filariasis dan Kecacingan, Ditjen P2PL, Kementerian Kesehatan RI, Jakarta