Kemunculan pita (band) berukuran 482 bp menunjukkan bahwa sampel Anda positif Virus Dengue Serotipe 1 (DENV-1). Pada protokol asli Lanciotti (1992), pita 482 bp terbentuk dari hasil penempelan pasangan primer D1 dan TS1.
Jika Anda menggunakan metode One-Step Multiplex RT-PCR (di mana primer universal dan primer spesifik dimasukkan ke dalam satu tabung reaksi sekaligus), tidak munculnya pita universal (511 bp dari pasangan D1 dan D2) adalah hal yang sangat wajar dan sering terjadi.
Berikut adalah beberapa penyebab utama mengapa band universal tidak muncul:
1. Kompetisi Primer (Primer Competition)
Dalam satu tabung reaksi yang berisi campuran (mix) primer, terjadi kompetisi kinetika penempelan antara primer universal (D2) dan primer spesifik serotipe (TS1).
- Jarak target amplifikasi antara D1 ke TS1 (menghasilkan 482 bp) lebih pendek daripada D1 ke D2 (menghasilkan 511 bp).
- Enzim polimerase secara alami lebih efisien dan lebih cepat menyelesaikan replikasi fragmen yang lebih pendek (482 bp). Akibatnya, reaksi amplifikasi didominasi oleh produk spesifik DENV-1, sehingga produk 511 bp tertekan dan tidak tervisualisasi di gel agarose.
2. Efisiensi Elektroforesis Gel Agarose
Ukuran 482 bp dan 511 bp memiliki selisih yang sangat kecil (hanya 29 bp).
- Jika Anda menggunakan gel agarose dengan konsentrasi standar (misalnya 1% atau 1.5%) dengan waktu running yang standar, kedua pita ini akan terlihat menyatu sebagai satu pita tebal di sekitar area ~480–500 bp.
- Anda memerlukan gel agarose konsentrasi tinggi (2% hingga 2.5%) dengan waktu running lebih lama untuk bisa memisahkan dua pita yang berukuran sedekat itu secara jelas.
3. Protokol Asli Lanciotti Adalah Nested PCR (Dua Tahap)
Perlu diingat bahwa protokol asli dari Lanciotti et al. (1992) sebenarnya didesain untuk Nested PCR (dua tahap terpisah), bukan one-step multiplex langsung:
- Tahap 1 (RT-PCR Primer Universal): Menggunakan primer D1 dan D2 untuk mendeteksi keberadaan virus dengue secara umum (menghasilkan pita universal 511 bp).
- Tahap 2 (Nested PCR / Serotyping): Produk dari tahap 1 diambil sedikit sebagai templat, lalu diamplifikasi kembali menggunakan campuran primer D1, TS1, TS2, TS3, dan TS4. Di tahap kedua ini, pita 511 bp biasanya akan habis atau kalah dominan karena primer TS1-TS4 menempel di bagian dalam (internal/nested) cetakan fragmen tersebut.
Solusi & Langkah Validasi Selanjutnya:
- Gunakan Kontrol Negatif & Positif: Pastikan Negative Control (NTC/air) tetap bersih tanpa pita untuk menjamin tidak ada kontaminasi primer-dimer.
- Uji Coba Singleplex Tahap Pertama: Jika Anda ingin memastikan apakah band universal 511 bp benar-benar bisa teramplifikasi dengan baik, lakukan PCR hanya dengan memasukkan primer D1 dan D2 saja (tanpa TS1). Jika pita 511 bp muncul, berarti kualitas RNA dan efisiensi reagen Anda sudah aman.
- Optimasi Konsentrasi Primer: Jika tetap ingin menggunakan metode one-step one-step, Anda bisa mencoba menurunkan sedikit konsentrasi primer TS1 dan meningkatkan konsentrasi primer D2 agar kompetisi reaksi menjadi lebih seimbang.