Pembuatan larutan Ethidium Bromide (EtBr) untuk elektroforesis biasanya dibagi menjadi dua tahap: membuat larutan stok (stock solution) dengan konsentrasi tinggi (10 mg/mL), lalu mengencerkannya menjadi larutan kerja (working solution) saat diaplikasikan pada gel agarosa atau sebagai larutan perendam.
🚨 PERINGATAN KESELAMATAN SANGAT PENTING 🚨
Ethidium Bromide adalah senyawa mutagen kuat dan bersifat karsinogenik (pemicu kanker).
Ethidium Bromide adalah senyawa mutagen kuat dan bersifat karsinogenik (pemicu kanker).
- Selalu gunakan Alat Pelindung Diri (APD) lengkap: lab coat, masker (terutama saat menimbang bubuk agar tidak terhirup), kacamata pelindung, dan sarung tangan nitril (ganti jika terkena cipratan).
- Lakukan penimbangan bubuk di dalam fume hood (lemari asam) untuk menghindari debu kimia.
Berikut adalah panduan langkah demi langkah pembuatannya:
1. Membuat Larutan Stok EtBr (10 mg/mL)
Umumnya laboratorium membuat larutan stok dalam volume kecil untuk mengurangi risiko kecelakaan kerja.
- Bahan & Alat:
- 100 mg Bubuk Ethidium Bromide
- 10 mL Akuades steril / Milli-Q water
- Tabung sentrifugasi polypropylene 15 mL (disarankan yang berwarna gelap/amber, atau bungkus dengan aluminium foil karena EtBr sensitif cahaya)
- Magnetic stirrer
- Cara Membuat:
- Timbang 100 mg bubuk Ethidium Bromide dengan sangat hati-hati di dalam lemari asam.
- Masukkan bubuk ke dalam tabung sentrifugasi atau labu Erlenmeyer gelap.
- Tambahkan sekitar 8 mL akuades terlebih dahulu.
- Larutkan menggunakan magnetic stirrer selama beberapa jam sampai semua bubuk benar-benar larut sempurna (larutan akan berwarna merah tua).
- Tepatkan volumenya hingga mencapai 10 mL dengan menambahkan akuades.
- Bungkus wadah dengan aluminium foil rapat-rapat dan simpan pada suhu ruang atau 4°C. Larutan ini stabil hingga bertahun-tahun.
2. Cara Pengaplikasian pada Elektroforesis (Larutan Kerja)
Konsentrasi akhir EtBr yang aman dan optimal untuk memvisualisasikan DNA adalah 0,2 – 0,5 µg/mL. Ada dua metode yang bisa digunakan:
Metode A: Dicampur Langsung ke dalam Gel (In-gel Staining) — Paling Populer
Metode ini paling sering dipilih karena menghemat waktu.
- Buat larutan agarosa dengan buffer (TAE atau TBE) lalu panaskan hingga larut sempurna.
- Dinginkan larutan agarosa hingga suhu sekitar 50°C – 55°C (hangat-hangat kuku / botol sudah bisa dipegang dengan tangan kosong).
- Catatan: Jangan memasukkan EtBr saat larutan masih mendidih karena uapnya bisa membawa zat mutagenik tersebut ke udara.
- Tambahkan larutan stok EtBr (10 mg/mL) dengan rasio 0,5 µg per 1 mL gel (atau mudahnya: 5 µL larutan stok untuk setiap 100 mL agarosa).
- Homogenkan dengan cara digoyang perlahan (jangan dikocok keras agar tidak timbul gelembung udara), lalu tuang ke cetakan gel.
Metode B: Perendaman Setelah Running (Post-electrophoresis Staining)
Metode ini membuat alat elektroforesis dan buffer running tetap bersih dari kontaminasi EtBr.
- Jalankan proses elektroforesis gel seperti biasa tanpa EtBr.
- Buat larutan perendam: Campurkan 25–50 µL larutan stok EtBr (10 mg/mL) ke dalam 100 mL akuades atau buffer dalam wadah plastik khusus.
- Rendam gel yang telah di-running ke dalam larutan tersebut selama 15 – 30 menit pada suhu ruang.
- Bilas gel dengan akuades bersih selama 5–10 menit untuk mengurangi latar belakang fluoresensi (destaining) sebelum diamati di bawah transilluminator UV.
🗑️ Pengelolaan Limbah EtBr
Limbah Ethidium Bromide tidak boleh langsung dibuang ke wastafel laboratorium. Saring limbah cair menggunakan karbon aktif (activated charcoal) atau tampung dalam wadah limbah B3 khusus berlabel toksik untuk dimusnahkan sesuai regulasi.