Untuk mengawetkan isolat kultur Virus Dengue (DENV) pada penyimpanan suhu -80°C, Anda memerlukan pendekatan yang berbeda dari bakteri. Virus Dengue adalah enveloped virus (virus beramplop) berbasis RNA yang strukturnya sangat rentan rusak akibat pembentukan kristal es dan pergeseran pH saat pembekuan.
Hindari penggunaan DMSO secara berlebihan jika isolat ditujukan untuk uji infektivitas langsung atau sekuensing RNA, dan jangan menggunakan gliserol dalam konsentrasi tinggi seperti bakteri karena dapat mendenaturasi kapsid virus.
Metode standar emas terbaik untuk membekukan Virus Dengue pada -80°C adalah menggunakan Fetal Bovine Serum (FBS) konsentrasi tinggi sebagai krioprotektan alami, dikombinasikan dengan media kultur dasar (seperti DMEM atau MEM).
Rekomendasi Komposisi & Formulasi Medium Preservasi
Rasio pencampuran standar yang paling aman untuk menjaga stabilitas titer Virus Dengue adalah 75% cairan supernatan kultur virus + 25% FBS Steril.
Berikut adalah panduan jumlah volume yang harus ditambahkan berdasarkan beberapa target total volume aliquot:
| Target Total Volume Per Cryovial | Volume Isolat Kultur Virus (75%) | Volume FBS Murni Steril (25%) |
|---|---|---|
| 0.5 mL (500 µL) Direkomendasikan | 375 µL | 125 µL |
| 1.0 mL (1000 µL) | 750 µL | 250 µL |
| 2.0 mL (2000 µL) | 1500 µL (1.5 mL) | 500 µL (0.5 mL) |
Catatan: Pastikan media kultur dasar Anda (misalnya Gibco MEM/DMEM) sudah mengandung penyangga pH bawaan seperti Sodium Bicarbonate atau tambahan HEPES 10–25 mM untuk menstabilkan pH pada rentang 7.2 – 7.4 sebelum dibekukan.
Prosedur Kerja & Protokol Penting Penyimpanan
- Gunakan Skala Aliquot Kecil (Single-use Aliquots):
Virus Dengue sangat sensitif terhadap freeze-thaw cycle (siklus beku-thaw). Mengalami 1 kali siklus beku-thaw tanpa stabilizer dapat menurunkan titer virus hingga 1 log (10 kali lipat). Simpanlah dalam volume kecil (misal 500 µL per tabung) agar sekali pakai langsung habis. - Proses Snap-Freezing (Pembekuan Cepat):
Setelah kultur virus dicampur homogen dengan FBS, lakukan pembekuan cepat (snap-freeze) menggunakan bantuan dry ice/etanol atau nitrogen cair sebelum dimasukkan ke dalam deep freezer -80°C. Pembekuan cepat mencegah terbentuknya kristal es besar yang dapat merobek amplop lipid virus. - Sentrifugasi Sebelum Pembekuan:
Pastikan supernatan kultur disintrifugasi terlebih dahulu (misalnya 500 × g selama 5 menit pada suhu 4°C) untuk memisahkan debris sel inang (seperti sel Vero atau C6/36) sebelum dicampur dengan FBS dan dibekukan. - Hindari Menyimpan dalam Bentuk Terlalu Encer (Undiluted vs Diluted):
Berdasarkan studi viabilitas DENV di -80°C, menyimpan stok virus dalam bentuk yang terlalu encer tanpa matriks protein pelindung (seperti FBS) akan mempercepat penurunan titer. Komponen protein di dalam FBS bertindak sebagai cryo-stabilizer makromolekul yang menyelubungi partikel virus.